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摘要
目的
探讨超声介导微泡携带激肽原酶靶向治疗技术对大鼠急性脑梗死后神经再生及血管新生的影响。
方法
线栓法建立局灶性大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，按随机数字表法分为超声介导激肽原酶微泡组、超声介导空白微泡对照组、超声辐照对照组、激肽原酶对照组、生理盐水对照组，每组24只。机械振荡法制备激肽原酶载药微泡。MCAO术后24h所有大鼠按不同组别予以尾静脉给药，每天1次，连续给药2d或6d。超声组在尾静脉给药的同时，予以超声辐照缺血侧颅骨10min。分别在第3天和第7天行神经功能评分，并处死大鼠，测量脑梗死体积，观察侧脑室室管膜下区(SVZ)双皮质素的表达变化和梗死灶周围血管密度层黏连蛋白表达的变化。
结果
术后7d超声介导激肽原酶微泡组、超声介导空白微泡对照组、超声辐照对照组、激肽原酶对照组、生理盐水对照组SVZ区在每20倍目镜视野下双皮质素阳性细胞数分别为.8±13.1、.7±11.6、.2±13.7、.5±12.4和.7±10.0，梗死灶周围区在每10倍目镜视野下层黏连蛋白免疫阳性百分比分别为10.0%±0.8%、5.2%±0.7%、5.0%±1.0%、8.0%±1.8%和5.0%±0.9%。其中，超声介导激肽原酶微泡组和激肽原酶组梗死侧SVZ区双皮质素阳性细胞数和梗死灶周围层黏连蛋白免疫阳性百分比均明显高于同时点超声介导空白微泡对照组、超声辐照对照组、生理盐水对照组(双皮质素：超声介导激肽原酶微泡组比超声介导空白微泡对照组、超声辐照对照组、生理盐水对照组，t＝17.88、17.17、18.16，P0.01；激肽原酶组比超声介导空白微泡对照组、超声辐照对照组、生理盐水对照组，t＝15.42、14.78、15.70，P0.01。层黏连蛋白：超声介导激肽原酶微泡组比超声介导空白微泡对照组、超声辐照对照组、生理盐水对照组，t＝7.01、6.71、7.11，P0.01；激肽原酶组比超声介导空白微泡对照组、超声辐照对照组、生理盐水对照组，t＝4.23、3.94、4.33，P0.01)。另外，超声介导激肽原酶微泡组与激肽原酶对照组相比，梗死侧SVZ区双皮质素阳性细胞数(t＝2.46,P0.05)及梗死灶周围层黏连蛋白免疫阳性百分比(t＝2.78，P0.05)均更高，差异有统计学意义。MCAO术后7d上述各组的神经功能评分超声介导激肽原酶微泡组与其他4组相比，差异均有统计学意义。
结论
超声介导激肽原酶载药微泡治疗较单用激肽原酶治疗更能促进大鼠MCAO术后的神经再生和血管新生，进一步改善大鼠急性脑梗死后的神经功能，因此，超声介导载药微泡靶向治疗技术有望进一步用于神经系统疾病的治疗。
近年来，超声造影和无创靶向治疗技术发展突飞猛进，各种可携带药物或基因的超声微泡造影剂不断研制成功，超声介导微泡造影剂携带药物靶向治疗技术在医学领域的应用日益广泛，该技术具有高效、靶向性强的优点[1]，可降低治疗成本和不良反应，且不影响药物的活性。超声介导微泡造影剂携带药物靶向溶栓技术目前尚处于体外实验阶段，并因药物时间窗的限制难以广泛应用。人尿激肽原酶是近年研制的国家Ⅰ类新药，可通过建立侧支循环、促进神经修复的双重机制来治疗急性脑梗死，时间窗宽广。我国于年9月至年12月进行的人尿激肽原酶治疗急性脑梗死多中心随机双盲安慰剂对照试验显示人尿激肽原酶能有效地改善急性脑梗死患者的神经功能缺损[2]。最新版的《中国急性缺血性卒中诊治指南》已把人尿激肽原酶列为急性缺血性卒中的治疗药物之一[3]。因此，我们创新性地选择激肽原酶作为微泡造影剂的载药对象，将载激肽原酶微泡经大鼠尾静脉注入后，采用超声辐照梗死区域，靶向性地治疗大鼠实验性急性脑梗死，观察其对神经干细胞活化和血管新生的影响。
材料和方法
一、研究对象、大脑中动脉闭塞(MCAO)模型的建立及实验分组
健康雄性SPF级Wistar大鼠(来自南方医科大学实验动物中心)只，按照Longa等[4]的方法，制作永久性MCAO模型。将MCAO大鼠采用随机数字表法随机分为超声介导激肽原酶微泡组、超声介导空白微泡对照组、超声辐照对照组、激肽原酶对照组和生理盐水对照组，每组各24只。本研究通过了广州医科大学实验动物伦理委员会的审查。研究时间为年3月到年10月。
二、激肽原酶载药微泡的制备、药物注射、超声辐照参数及5–溴脱氧嘧啶核苷(BrdU)腹腔注射
将激肽原酶(广东天普生化医药股份有限公司)0.4ml与微泡(声诺维微泡，BraccoSuisseSA公司，瑞士)0.1ml混合，采用机械振荡法振荡45s，即得到载药微泡，药物携带率为93.46%±1.7%，药物包封率为52.5%±0.8%[5]。超声介导激肽原酶微泡组、超声介导空白微泡对照组、超声辐照对照组分别在MCAO术后24h经尾静脉注射载药微泡、空白微泡、生理盐水，给药量为0.5ml，激肽原酶给药剂量为1.6×10–2PNAU·kg–1·d–1(PNAU为对硝基苯胺单位，即在37℃﹑pH值＝8.0的条件下，1min水解1μmolVal–Leu–Arg–对硝基苯胺的尤瑞克林量为1对硝基苯胺单位)，尾静脉注射的同时给予经颅多普勒(RIMED公司，以色列)超声辐照10min，每天1次，连用2d或6d。辐照条件为：超声探头直径1.5cm，超声脉冲频率2MHz，最大深度55mm，辐照时探头紧靠MCAO大鼠缺血侧眼外眦与耳连线处的颅骨，并与缺血侧颅骨垂直。激肽原酶对照组、生理盐水对照组分别经尾静脉注射等剂量等疗程的激肽原酶、生理盐水。所有大鼠MCAO术后24h起每天2次经腹腔注射BrdU(50mg/kg，Sigma公司，美国)，连续2d或6d，用以标记新增殖细胞。
三、神经功能评分
在MCAO术后3d和7d，每组随机选取6只大鼠，用Bederson评分标准进行神经功能评价[6]。
四、氯化三苯四唑(TTC)染色评估梗死灶体积
从不同时点的5组MCAO大鼠中各取6只，行TTC(Sigma公司，美国)染色后拍照。图像采用ImageProPlus6.0软件处理计算梗死体积，按公式[(各片正反面梗死面积之和/2)×片厚]/[(各片正反面总面积之和/2)×片厚]×%，计算梗死体积占所取脑组织体积的百分比[7]。
五、灌注、取材及制片
将评分后的大鼠麻醉后，经主动脉弓快速灌注生理盐水ml，然后换用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液ml灌注固定，开颅取脑，继续用上述固定液固定6～8h后，再依次置于15%、30%蔗糖多聚甲醛磷酸盐缓冲液中，直至大脑全部沉入瓶底，行片厚30μm的冰冻切片。
六、免疫荧光检测
冰冻切片采用免疫荧光法检测，一抗分别为：山羊抗大鼠双皮质素多克隆抗体(1∶，SantaCruz公司，美国)，兔抗大鼠层黏连蛋白多克隆抗体(1∶，Sigma公司，美国)，小鼠抗大鼠BrdU(1∶，Sigma公司，美国)。4℃混合孵育过夜，PBS漂洗数次，然后与荧光标记的二抗：驴抗山羊异硫氰酸荧光素(1∶，SantaCruz，美国)，羊抗小鼠AlexaFlour(1∶，Jackson公司，美国)及驴抗兔AlexaFlour(1∶，Invitrogen公司，美国)，室温孵育1.5h。封片后荧光显微镜(LEICADMIRB公司，德国)下采集图像。每张切片在侧脑室室管膜下(SVZ)区和梗死灶周围区随机选6个视野，每个视野间距μm，结果用6个视野的平均数表示。层黏连蛋白免疫阳性百分比表示毛细血管密度。梗死灶周围皮质层黏连蛋白表达的图片在10倍物镜(μm×μm)下拍照，双皮质素表达的细胞图片在20倍物镜(μm×μm)下拍照，并以软件ImageProPlus6.0进行分析。
七、统计学方法
采用SPSS17.0软件进行统计分析，正态分布的计量资料数据用均值±标准差表示，计量资料多组数据间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验；等级资料用中位数(四分位数)[即M(Q25，Q75)]表示，采用Mann–WhitneyU检验。P0.05表示差异有统计学意义。
结果
一、神经功能评分
在MCAO术后3d和7d，超声介导激肽原酶微泡组神经功能评分分别与同时点其余4组对照组相比较(表1)，术后7d超声介导激肽原酶微泡组与其他4组对照组比较，差异均有统计学意义。
表1
各组大鼠术后Bederson评分比较
二、脑梗死体积的测定
TTC染色示，超声介导激肽原酶微泡组在MCAO术后不同时点的脑梗死体积(用梗死体积占所取脑组织体积的百分比表示)与同时点其他4组对照组比较，差异无统计学意义(表2)。
表2
各组大鼠不同时间点梗死体积的比较(%，±s)
三、内源性神经干细胞的增殖
免疫荧光单标染色显示MCAO术后7d，超声介导激肽原酶微泡组梗死侧SVZ区双皮质素阳性表达的细胞数明显高于同时间点其他4组对照组(表3，图1)。
图1
大鼠行大脑中动脉闭塞术后7d梗死侧侧脑室室管膜下区双皮质素＋免疫阳性细胞(免疫荧光单标染色)。A～E分别为超声介导激肽原酶微泡组、超声介
表3
各组大鼠不同时间点手术侧侧脑室室管膜下区双皮质素阳性细胞数(±s)
四、脑梗死灶周围的血管密度
免疫荧光单标染色检测发现，MCAO术后7d，超声介导微泡激肽原酶组的脑梗死灶周血管密度明显增多，且高于其他4组对照组(表4，图2)。免疫荧光双标染色可见层黏连蛋白/BrdU免疫阳性共表达细胞。
图2
大鼠行大脑中动脉闭塞术后7d梗死灶周围的层黏连蛋白免疫阳性细胞(免疫荧光单标染色)。A～E分别为超声介导激肽原酶微泡组、超声介导空白微泡对照组、超声辐照对照组、激肽原酶对照组、生理盐水对照组。F～H分别为超声介导激肽原酶微泡组层黏连蛋白免疫阳性表达、BrdU免疫阳性表达、层黏连蛋白/BrdU免疫阳性共表达细胞。所有图片放大倍数相同
表4
各组大鼠不同时间点手术侧梗死灶周围血管密度(%，±s)
讨论
超声介导载药微泡靶向药物释放(ultrasound–targeteddrugloadedmicrobubbledestruction，UTMD)技术是静脉注入载药微泡后，在指定部位行超声辐照，超声波产生空化效应致体内载药微泡破裂，同时对周围组织产生生物学效应，实现局部释放药物并增加组织对药物的摄取。张群霞等[8]将微泡造影剂经尾静脉输入下肢血管闭塞模型鼠中，并行超声辐照，治疗14d后发现缺血下肢骨骼肌中有较多的血管内皮生长因子阳性表达颗粒，且骨骼肌中的微血管密度增加，提示采用微泡超声空化法可促进缺血组织内源性血管内皮生长因子生成，增加血管新生。Liao等[9]利用UTMD的无创性、低免疫原性及靶向特异性，结合基因治疗，证实该方法可以促进血管的新生，从而为治疗心血管疾病提供一种新的方法。另外，国际多中心临床研究CLOTBUST证实：静脉注射重组组织型纤溶酶原激活剂后联合2h的经颅多普勒治疗可明显提高再通率，并使3个月后的良好预后率提高了13%[10]。部分临床试验证实同时应用微泡造影剂可降低超声治疗的强度，从而进一步提高超声助溶的效率和降低出血等不良反应，而且体内使用微泡造影剂是安全的[11,12]。因此我们利用该技术，观察其对大鼠急性脑梗死后的影响。
SVZ区是成年哺乳动物脑的神经再生的一个重要区域[13,14]。脑缺血后可引起SVZ区内源性神经再生[15,16]。双皮质素是一种微管相关蛋白，是具有迁移能力的不成熟神经元的的标志[17,18]，我们将其用于观察神经再生的情况；层黏连蛋白是血管基膜的标志。BrdU是新增殖细胞标志物。BrdU＋/层黏连蛋白＋提示为新增殖的血管，用以观察血管新生的情况。我们发现无论MCAO术后3d还是7d，激肽原酶与超声介导空白微泡对照组、超声辐照对照组和生理盐水对照组相比，脑梗死同侧的SVZ区和梗死灶周围双皮质素＋和层黏连蛋白＋细胞数目显著增加，提示激肽原酶促进了神经与血管的再生，这与国内外的研究结果一致。同时，与激肽原酶组相比，超声介导激肽原酶微泡组在MCAO术后7d的双皮质素＋和层黏连蛋白＋细胞数目显著增多，神经功能学评分显著降低，这提示超声介导激肽原酶微泡的靶向治疗能更加显著地促进局灶性大脑中动脉缺血后内源性神经干细胞的活化以及毛细血管新生，同时改善神经功能，其效果优于单用激肽原酶或单用微泡。然而，超声介导激肽原酶微泡组、激肽原酶对照组与其他对照组相比，未能减小梗死体积，这与Xia等[19,20]报道的激肽原酶减小MCAO大鼠的脑梗死体积不一致，这可能是由于治疗时间与治疗方法不同。Xia等[19,20]于MCAO术后1h侧脑室给药，而我们于24h后开始治疗，此时梗死灶已经形成且不可逆转，所以梗死体积无减少。
综上所述，超声介导激肽原酶载药微泡的靶向治疗技术能更加显著地促进大鼠局灶性大脑中动脉缺血后神经的再生及血管的新生，并进一步改善大鼠急性脑梗死后的神经功能。超声介导载药微泡治疗技术靶向性强，药效高，药物活性不受影响，疗效显著，有望进一步应用于治疗神经系统疾病。
参考文献
[1]
KlibanovAL,ShevchenkoTI,RajuBI,etal.Ultrasound–triggeredreleaseofmaterialsentrappedinmicrobubble–liposomeconstructs:atoolfortargeteddrugdelivery[J].JControlRelease,,(1):13–17.
[2]
丁德云,吕传真,丁美萍,等.人尿激肽原酶治疗急性脑梗死多中心随机双盲安慰剂对照试验[J].中华神经科杂志,7,40(5):–.
[3]
中华医学会神经病学分会脑血管病学组急性缺血性脑卒中诊治指南撰写组.中国急性缺血性脑卒中诊治指南[J].中华神经科杂志,,43(2):–.
[4]
LongaEZ,WeinsteinPR,CarlsonS,etal.Reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomyinrats[J].Stroke,,20(1):84–91.
[5]
陈佳,梁燕玲,郑璿,等.机械振荡法制备激肽原酶载药微泡的实验研究[J].神经损伤与功能重建,,9(2):95–99.
[6]
BedersonJB,PittsLH,TsujiM,etal.Ratmiddlecerebralarteryocclusion:evaluationofthemodelanddevelopmentofaneurologicexamination[J].Stroke,,17(3):–.
[7]
RapoportN,GaoZ,KennedyA.Multifunctionalnanoparticlesfor白癜风好的医院好的白癜风医院在哪
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