Bioact.Mater.:用于动脉穿刺的高粘性止血水凝胶涂层的微流体辅助优化
Title:Microfluidics-assistedoptimizationofhighlyadhesivehaemostatichydrogelcoatingforarterialpuncture
Authors:XingjieYin,JingliRen,WeiLan,YuChen,MengpingOuyang,HuaSu,LianbinZhang,JintaoZhu,ChunZhang*
BioactiveMaterials,,
DOI:10./j.bioactmat..10.
引言
虽然在临床实践中很常见，但组织穿刺后的出血可能会导致严重的后果，尤其是在动脉穿刺中。在此，制备了具有不同成分的明胶-单宁酸复合水凝胶，并在基于微流体通道的模拟血管中进一步优化了它们的粘附性能，用于动脉穿刺止血。结果表明，用于动脉穿刺的注射器针头上的复合水凝胶应具有高于4.9kPa的水下粘附力和高于86.0kPa的机械强度。在不同动物模型中，涂有明胶-鞣酸复合水凝胶的针头可完全防止静脉和动脉穿刺后的失血。该研究对制备血管穿刺用止血针具有重要意义，明胶-单宁酸水凝胶涂层针可能有助于预防与动脉穿刺相关的并发症。
华中科技大学ChunZhang（通讯作者）课题组，提出了动脉穿刺止血的具有不同成分的明胶-单宁酸复合水凝胶。相关成果以“Microfluidics-assistedoptimizationofhighlyadhesivehaemostatichydrogelcoatingforarterialpuncture”为题发表在《BioactiveMaterials》上。
图文导读
图1.不同TA质量含量的Gel-TA的附着力和机械性能
a在D2O中获得的1HNMR光谱。b在血清中溶胀后水凝胶薄膜的流变学分析。c应变-应力曲线。d对猪皮肤的粘附强度和e凝胶-1%TA、凝胶-2%TA、凝胶-3%TA和凝胶-4%TA水凝胶的爆裂压力。
通常，为了在动脉中实现止血，水凝胶应紧密且完整地粘附在高血压下的伤口上。通过改变水凝胶中明胶和TA之间的质量比，可以仔细调整机械和粘合强度。TA质量含量为1%、2%、3%和4%的四组样品（以下分别记为Gel-1%TA、Gel-2%TA、Gel-3%TA、Gel-4%TA）。1HNMR光谱证实了水凝胶的成功合成，吸收峰在TA的苯酚-OH基团的~6.8ppm处增加（图1a）。流变分析用于研究凝胶-TA的机械强度。如图1b所示，Gel-2%TA在样品中表现出最好的机械性能，其储能模量(G)为95.2kPa大于其损耗模量(G,67.7kPa)。同样，其机械性能也通过应变应力测试得到证实，表明Gel-2%TA的强度值最高，为1.8MPa（图1c）。由于水凝胶必须立即粘附在穿刺部位以止血，所以水凝胶的粘附强度是血管止血的重要因素。因此，使用搭接剪切强度测试来评估上述样品的粘合强度。结果表明，不同TA质量含量的Gel-TA的粘合强度分别为25.3kPa、30.7kPa、39.3kPa和24.4kPa（图1d）。所有水凝胶都显示出高于正常血压（mmHg）的爆裂压力（图1e）。此外，Gel-2%TA水凝胶显示出最高的爆裂压力(mmHg)。
图2.止血涂层的微流体系统评估
a在mmHg压力下模拟容器中FITC-Gel-TA、RhB-Alg和荧光素钠纤维蛋白胶的形态。b37°CPBS溶液中水凝胶力分布的CFD模拟示意图。cCFD模拟水凝胶在37℃PBS溶液中的粘附力和d机械强度。e粘合强度和机械强度随水凝胶长高比的变化。
本实验发现荧光素标记的Gel-TA在正常动脉压力（mmHg）下紧密粘附在内表面，没有任何形态变化（图2a）。然而，藻酸盐-Ca(Alg)水凝胶和纤维蛋白胶，一种用于低压血管止血的市售手术胶，在这种情况下被迅速冲走（图2a）。与Gel-TA(30.7kPa)水凝胶相比，Alg(2.3kPa)水凝胶和纤维蛋白胶(8.6kPa)的粘附力要低得多。理论上，水凝胶的水下粘附力为4.9kPa，在正常血压（mmHg）下机械强度为86.0kPa（图2b-d）。我们发现粘附力和机械强度都随着水凝胶长高比的增加而变化（图2e）。值得注意的是，这仅适用于水凝胶粘附在血管内壁上。纤维蛋白胶虽然理论上可以满足上述正常血压（mmHg）下粘附强度的要求，但它不具备儿茶酚结构的Gel-TA那样的持久的水下粘附。
图3.止血针的特性
a厚度和b长度（从左到右）22G、25G和30G止血针上的涂层。c针的摩擦。dGel-TA的细胞相容性评估。
根据不同针头的要求调整涂层的长度和厚度，在本研究中，现有的涂层长度和厚度可以满足血液静力学要求（图3a和b）。此外，止血针(22G)表现出比裸针低得多的摩擦力（图3c）。此外，通过与3T3成纤维细胞共培养，进行了CCK-8细胞活力测定，其高于95%，揭示了Gel-TA的优异生物相容性（图3d）。
图4.凝胶TA涂层针在静脉穿刺中的止血特性
a大鼠颈外静脉穿刺图像：顶部为裸针，底部为凝胶TA涂层针。b大鼠颈外静脉（n=4，****p0.）、大鼠下腔静脉（n=4，****p0.）和兔耳静脉（n=4，****p0.）。c经止血针穿刺后颈外静脉的高分辨率超声图像。d用Gel-TA涂层的22G针穿刺前后颈外静脉的血流量（n=6，p0.05）。e大鼠下腔静脉穿刺图像：顶部为裸针，底部为Gel-TA涂层针。f兔耳静脉穿刺图像：左为裸针，右为凝胶TA涂层针。
为了评估Gel-TA在体内的止血效果，首先通过刺穿大鼠颈外静脉和下腔静脉以及兔耳静脉，测试了Gel-TA涂层针对不同血压静脉的止血效果。观察到Gel-TA涂层的22G针组没有失血（图4a和b），而血液明显从裸针穿刺的颈外静脉流出，平均出血量为.9±16.1μL（图4a和b）。随后，使用小动物超声检查使用止血针穿刺前后的血管腔和血流量。结果显示血管通畅，无明显狭窄或血栓形成，并且用凝胶-TA涂层针穿刺后血流量没有变化（图4c和d）。
为了评估止血针在高压静脉中的止血能力，穿刺大鼠下腔静脉。如图4b、e所示，凝胶-TA涂层针（22G）在穿刺后显示完全止血。相反，裸针穿刺导致明显出血，平均出血量为2.1±0.2mL（图4b、e）。兔耳静脉比较浅，属于经皮穿刺，在临床上可以更好地模拟静脉穿刺的操作。兔耳静脉穿刺时，裸针（25G）再次引起明显出血，平均出血量为.2±7.5μL（图4b，f），而Gel-TA涂层针未观察到出血（图4b、f）。
图5.Gel-TA良好的生物相容性
aPT和aPTT测试（n=4，p0.05）。b、c显示穿刺后12小时Cr、Bun、ALT和AST的直方图（n=4，p0.05）。d-g图显示了用Gel-TA涂层和裸针穿刺后白细胞(WBC)、单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞水平的血细胞计数分析（n=4，p0.05）。
此外，穿刺后，收集兔血样以分析PT和aPTT。两组之间未发现显着差异，表明全身凝血功能不受Gel-TA的影响（图5a）。同时，在穿刺后12h检测到Cr、Bun、ALT和AST。我们还在穿刺后第0、1、7和14天测试了血细胞计数，以评估Gel-TA涂层的生物相容性。结果表明，与裸针类似，Gel-TA涂层针对Cr、Bun、ALT、AST或血细胞计数没有显着影响（图5b-g），表明Gel-TA具有良好的生物相容性。
图6.体内成像演示
Cy5标记的Gel-TA止血涂层的体内成像（n=3）。
此外，连续观察14天，两组兔耳静脉穿刺部位均未出现明显炎症。为了评估Gel-TA的体内降解性，使用涂有Cy5标记的Gel-TA的止血针穿刺小鼠颈外静脉。成像系统测量的结果显示荧光信号逐渐减弱，Gel-TA在第10天完全降解（图6）。
图7.动脉穿刺止血针的止血能力评价
a大鼠腹主动脉穿刺图像：裸针（左）和凝胶TA涂层针（右）。b大鼠腹主动脉穿刺（n=4，****p0.）和兔股动脉穿刺（n=4，****p0.）出血的定量分析。c.用凝胶-TA涂层针(30G)穿刺的大鼠腹主动脉的H-E染色。d兔股动脉穿刺图像：左侧为裸针，右侧为Gel-TA涂层针。
与静脉穿刺相比，动脉穿刺止血更困难，因为血压较高。为了检查凝胶TA涂层针在动脉穿刺中的止血效果，使用凝胶TA涂层30G针或裸针作为对照穿刺大鼠的腹主动脉。将凝胶-TA涂层针的止血效果与裸针进行比较。具体而言，止血针完全防止出血，而裸针导致失血1.7±0.2mL（图7a和b）。为了验证水凝胶可以物理密封伤口，收集了被止血针刺破的腹主动脉，并使用H-E染色进行分析。在血管内壁中观察到分离的Gel-TA，并且没有阻塞腹主动脉的管腔（图7c）。后刺破兔股动脉以确认凝胶-TA涂层针的止血能力。显然，裸针（30G）导致显着出血，出血量为.2±17.9μL（图7b、d）。相比之下，止血针没有引起出血（图7b、d）。
小结
总之，本实验开发了一种新型微流体平台来评估止血针涂层的粘附与血管压力之间的关系。此外，Gel-TA的粘合强度可以通过改变明胶和TA的成分来控制。为实现动脉穿刺止血，水凝胶的水下粘附力应高于4.9kPa，机械强度应高于86.0kPa。在不同的动物模型中，Gel-TA涂层针头可以完全防止静脉和动脉穿刺后的出血。本研究为制备不同血管的止血针提供了有效证据。
申明：本
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