分子靶向诊疗18FFDGmicr

文章来源：中华核医学与分子影像杂志,,38(11):-

作者：彭一檬张春银余录谭华尤强

单位：　泸州，医院核医学科

引用本文：彭一檬,张春银,余录,等.18F－FDGmicroPET/CT在脑缺血再灌注模型筛选中的应用[J].中华核医学与分子影像杂志,,38(11):-.DOI:10./cma.j.issn.-..11.

Applicationof18F-FDGmicroPET/CTinthescreeningofcerebralischemiareperfusionmodels

PengYimeng,ZhangChunyin,YuLu,TanHua,YouQiang

CiteasChinJNuclMedMolImaging,,38(11):-.DOI:10./cma.j.issn.-..11.

摘要

目的

探讨18F－脱氧葡萄糖(FDG)microPET/CT显像筛选脑缺血再灌注(CIR)模型的可行性。

方法

采用线栓法可逆性栓塞大脑中动脉制作大鼠CIR模型。术后清醒时，将Zea－Longa评分1～4分视为入选标准。共选取18只雄性SD大鼠。术后2和24h，采用Garcia18评分法进行大鼠神经功能评分。建模后2和24h经尾静脉注射18F－FDG,40min后行microPET/CT显像，对图像进行视觉分析及半定量分析。对意外死亡的大鼠进行尸体解剖及HE染色；对术后24h存活大鼠，在完成microPET/CT显像后取脑组织行氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，观察脑梗死情况。以病理检查结果为"金标准"，采用Fisher确切概率法分析比较神经功能评分与microPET/CT评价CIR模型的准确性。

结果

18只入选大鼠的病理结果为：CIR模型11只，蛛网膜下腔出血(SAH)4只，SAH伴脑出血3只。术后8～12h，4只大鼠意外死亡。术后2h，神经功能评分及microPET/CT的诊断准确性分别为11/18和15/18，差异有统计学意义(P0.05)；术后24h，神经功能评分及microPET/CT的诊断准确性分别为11/14和14/14，差异无统计学意义(P0.05)。

结论

18F－FDGmicroPET/CT可比神经功能评分更早地筛选出CIR模型。

制备理想、稳定的脑缺血再灌注(cerebralischemiareperfusion,CIR)模型是进行缺血性脑血管疾病研究的前提。CIR模型的制作方法很多，以线栓法制作的大脑中动脉阻塞/再灌注(middlecerebralarteryocclusion/reperfusion,MCAO/R)模型最常见，然而线栓插入过程中极易造成蛛网膜下腔出血(subarachnoidhemorrhage,SAH)及脑出血。为了后续实验的顺利开展，需剔除SAH及脑出血大鼠，筛选出梗死灶相对恒定的MCAO/R模型鼠。以往文献[1,2]通常以术后清醒时及术后24h具有神经功能缺损表现为造模成功的标准，少数采用3.0TMR观察评估MCAO/R术后大鼠。本研究以病理结果为"金标准"，采用18F－脱氧葡萄糖(fluorodeoxyglucose,FDG)microPET/CT显像及Garcia神经功能评分对MCAO/R术后清醒时具有神经功能缺损表现的大鼠进行评估，对比两者在CIR模型筛选上的准确性，探讨microPET/CT评估CIR模型的可行性。

材料与方法

1．CIR模型制作。选取18只健康雄性SD大鼠，体质量～(.0±14.6)g。由西南医科大学城北实验动物中心提供，许可证号：SCXK(川)－17。大鼠经腹腔注射质量分数10%的水合氯醛(按体质量3ml/kg)麻醉后，仰卧位固定，常规消毒颈前区皮肤，颈前正中线偏右侧切口，钝性分离血管。将右侧颈外动脉及颈内－外交通动脉用双线结扎，并从中剪断血管；结扎右侧翼腭动脉，右颈内动脉绕线备用，右颈总动脉夹闭。在右颈外动脉残端(近颈总动脉分叉处)用眼科剪剪一"V"形小口，将头端圆钝、直径约为0.32mm的线栓插入，插入深度约为1.8～2.0cm时，遇阻力立刻停止插线；结扎右颈内动脉备线固定栓线，松开右颈总动脉动脉夹，逐层缝合切口并消毒。阻断1h后，拔出线栓再灌注。

2．CIR建模术后清醒时大鼠筛选标准。大鼠CIR建模术后清醒时，参照简易的Zea－Longa评分标准[3]进行评分：0分，神经功能正常；1分，提尾使之四肢悬空，左前肢屈曲或与右前肢伸展程度不一致；2分，自由行走时，绕尾、向左侧转圈；3分，自由行走时，身体向左侧倾斜、倾倒；4分，无自发行走，意识未丧失；5分，与脑缺血相关的死亡。入选标准：(1)具有神经功能缺损表现的大鼠，即神经功能评分1～4分；(2)空腹血糖浓度7.0mmol/L[4,5]。不合格者排除后，取同级别大鼠按前述方法造模补齐18只。

3．Garcia神经功能评分。分别于术后2、24h，采用Garcia18评分法[6]评价MCAO/R术后清醒时具有神经功能缺损的大鼠，该方法包括对大鼠自主运动、感觉及反射方面的评价，较Zea－longa法评分更完善。详见表1。

4．18F－FDGmicroPET/CT显像及图像分析。MicroPET/CT为德国Siemens公司InveonMultimodalitySystem，工作站配备Inveon采集工作平台(InveonAcquisitionWorkplace)及ASIProVM分析软件系统。18F－FDG由本院核医学科采用德国Siemens公司EclipseHD回旋加速器及自动化学合成系统自行制备，放化纯98%，pH值为5.6。建模后2、24h分别行microPET/CT显像，大鼠经腹腔麻醉后，经尾静脉注射18F－FDG18.5～37.0MBq(约0.2ml)。根据以往文献[7,8]，注射后10min，脑组织显像剂摄取达最高峰，40～50min显像本底下降，为最佳采集时间；故本研究选取注射后40min行microPET/CT显像。CT部分采集曝光ms，采用锥束重建滤波反投影法(filteredbackprojection,FBP)进行重建，PET部分采集时长约10min，二维FBP进行重建；采用ASIProVM分析软件系统进行图像后处理、分析。

对microPET/CT图像进行视觉及半定量分析，视觉分析包括梗死部位、范围及18F－FDG摄取情况的评估。半定量分析采用ASIProVM软件，在缺血灶最大层面勾画面积为6mm2的感兴趣区(regionofinterest,ROI)，记为ROI1；在对侧大脑半球相同位置勾画等面积的ROI，记为ROI2，测量标准摄取值(standardizeduptakevalue,SUV)，计算最大标准摄取值(maximumstandardizeduptakevalue,SUVmax)和靶/非靶组织放射性(target/non－target,T/NT)比值。

5．病理学评价。对发生意外死亡的大鼠，进行尸体解剖并切片行HE染色。对于术后24h存活大鼠，经microPET/CT显像后，快速断头取脑，将脑组织置于－20℃冰箱冰冻20min，去除嗅球、脑干及小脑半球，从额极向枕极每隔2mm切片。将切片置于pH值7.4、温度37℃的含质量分数2%氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazoliumchloride,TTC)的溶液中，避光温育30min，每隔5min翻动脑片，使脑片染色均匀，用磷酸盐缓冲液(phosphate－bufferedsolution,PBS)冲洗多余染料。然后用质量分数4%的中性甲醛固定。

6．统计学处理。利用IBMSPSS24.0软件进行分析处理，符合正态分布的计量资料采用±s表示；若数据方差齐，则采用两样本t检验；若方差不齐，则采用方差不齐的t′检验。神经功能评分和microPET/CT评价MCAO/R模型准确性的比较采用Fisher确切概率法。以P0.05为差异有统计学意义。

结　果

1．术后行为学观察及神经功能缺损评分。18只入选大鼠在术后2h时均存活，精神状态差，少有自发运动，不喜进食、进水，神经功能缺损评分为6.27±1.77；4只大鼠于术后约8～12h出现意外死亡。术后24h，14只大鼠存活，其中2只大鼠神经功能缺损症状明显加重，四肢完全瘫痪，无自主运动；余大鼠精神状态有所恢复，自发运动次数相对增加，开始饮水，神经功能缺损评分为7.35±2.09。存活的14只大鼠术后2、24h的神经功能评分差异无统计学意义(t＝－1.50，P0.05)；经病理证实为MCAO/R模型的11只大鼠，术后2、24h的神经功能评分分别为6.60±1.36和8.20±0.90，差异有统计学意义(t＝－3.30，P0.05)。

2．18F－FDGmicroPET/CT显像(图1)。术后2h，18只存活大鼠均行microPET/CT显像，其中4只大鼠双侧大脑半球显像剂摄取均匀、对称，未见显像剂异常浓聚(或稀疏)区(图1A)，ROI1的SUVmax为2.57±0.04；余14只大鼠在右侧大脑半球区域可见18F－FDG分布稀疏、减低区(图1D、图1G)，ROI1的SUVmax为1.88±0.07,ROI2的SUVmax为2.52±0.18，差异有统计学意义(t′＝－11.9,P0.01)。术后24h，14只大鼠存活，其中3只大鼠无糖代谢减低区，SUVmax为2.30±0.27，余11只大鼠右侧大脑半球可见糖代谢减低区，ROI1的SUVmax为1.35±0.07，ROI2的SUVmax为2.23±0.22,差异有统计学意义(t′＝－12.0,P0.01)；病理证实的11只MCAO/R模型，术后2和24h的T/NT比值分别为0.74±0.06和0.61±0.04，差异有统计学意义(t＝6.0，P0.01)。

图1蛛网膜下腔出血(SAH)、大脑中动脉阻塞/再灌注(MCAO/R)模型及SAH伴脑出血大鼠的18F－脱氧葡萄糖(FDG)microPET/CT显像、大体标本及病理检查图。SAH大鼠的脑组织18F－FDG摄取均匀一致(A)，氯化三苯基四氮唑(TTC)染色示脑组织呈均匀红染(B)，脑实质无水肿表现，组织细胞排列规整(C；HE×40)。MCAO/R模型大鼠右侧大脑半球18F－FDG分布稀疏、甚至空白缺损，表现为糖代谢减低区(D)；左侧大脑半球及小脑颜色较正常脑组织浅淡，右侧大脑半球呈苍白色(E)；TTC染色示右侧大脑半球呈大片苍白梗死灶(F)，范围与18F－FDG代谢减低区基本一致。SAH伴脑出血大鼠的右侧额叶区见18F－FDG代谢稀疏或空白缺损区(G)；颅底Willis环内可见血液聚集，右侧外侧裂池可见血凝块形成(H)；脑组织内见大片红细胞，周围神经细胞肿胀(I；HE×)

3．大体解剖及TTC染色结果。意外死亡大鼠大体解剖示：颅底可见Willis环内血液聚集并有血凝块形成(图1H)，HE染色示SAH大鼠神经细胞排列整齐、规则，未见脑组织淡染区(图1C)；3只大鼠右侧大脑半球可见大片红细胞，周围神经细胞水肿明显(图1I)。术后24h，取出14只存活大鼠的脑组织行TTC染色，其中3只大鼠大体解剖示颅底可见血凝块，TTC染色呈均匀红染(图1B)；余11只大鼠大体解剖示右侧大脑半球颜色较左侧苍白(图1E)，TTC染色示右侧大脑半球局部呈苍白色，以右侧额颞顶叶及基底节区为主(图1F)。

以病理结果为CIR建模成功"金标准"，结果发现18只具有神经功能缺损表现的大鼠中，有11只为CIR模型，4只大鼠为SAH，3只大鼠为SAH伴脑出血。术后2、24h存活大鼠神经功能评分均为阳性，术后2h的准确性为11/18，术后24h准确性为11/14。术后2hmicroPET/CT显像，4只大鼠为阴性，3只大鼠为假阳性；术后24h显像，3只大鼠为阴性，术后2、24h的microPET/CT诊断的准确性分别为15/18和14/14。确切概率法结果表明，术后2h，神经功能评分与microPET/CT评价准确性间的差异有统计学意义(P0.05)；术后24h，神经功能评分与microPET/CT评价准确性间的差异无统计学意义(P0.05)。

讨　论

自从年Zea－Longa提出5分法作为模型筛选标准以来，神经功能评分作为经典的评价方法一直沿用至今。Garcia18分法、LudmilaBelayev12分法、前肢踏空实验、提尾悬空摇摆实验(elevatedbodyswingtest,EBST)评分等多种神经功能评分方法也相继被提出。Zea－Longa评分可以反映运动区域受损情况，前肢踏空实验主要反映前肢对运动及视觉、触觉的整合能力，EBST仅在脑缺血早期能反映身体运动不对称性。Garcia18分法能较全面评价模型，故本研究选用此方法。

影像学评价CIR模型的主要方法是CT灌注成像和MRI。理论上CT灌注成像可见梗死灶灌注明显减低，但是国内很少有小动物CT，这使得CT灌注成像用于模型评价受到了限制。MRI脑组织分辨率相对较好，既往有研究[9]采用3.0TMR通过缺血部位对MCAO/R术后大鼠进行筛选，来区分脑出血大鼠(呈T2低信号)和脑缺血大鼠(呈T2高信号)。还有研究[10]发现，碘造影剂及继发性出血对MRI信号有影响，如果T2信号减低，而梯度回波T2*成像信号不减低，则为碘造影剂所致；若T2及梯度回波T2*信号均减低，则为继发性出血，据此可以剔除脑出血大鼠。T2弛豫时间定量图谱相关研究[11]发现，梗死灶qT2′低于对侧镜相ROI，局部脑血流(regionalcerebralbloodflow,rCBF)与qT2′存在相关性；qT2′可以反映脑血流灌注，在无辐射、无对比剂使用的情况下能很好地评估CIR模型。CT灌注成像、MRI主要是从血流灌注及形态学方面评价CIR模型。

本实验入组的大鼠为术后清醒时具有神经功能缺损者，经过病理证实，除CIR大鼠，还存在SAH大鼠和SAH伴脑出血大鼠。由于上述大鼠存活时均具有神经功能缺损表现，故无法通过神经功能评分将其加以区分。出现SAH及脑出血大鼠，是因为线栓置入是盲插过程，头端位置仅凭轻微的阻力决定，然而在感觉到阻力后，栓线再进入3mm就会造成SAH[12]，甚至合并脑实质出血。SAH一般无脑实质损伤，脑葡萄糖代谢均匀，无局灶性显像剂分布减低区，因此利用microPET/CT很容易剔除。SAH伴脑出血的大鼠，因颅内有出血灶，邻近脑组织水肿，糖代谢会出现局限性减低；此类大鼠与MCAO/R模型都是损伤的大脑中动脉，病灶累积区域及显像剂分布差异不大，从microPET/CT图像上较难区分。理论上出血灶在CT图像上表现为高密度影，但是本实验的microPET/CT中CT为单排CT，不能很好地显示病灶情况。此类大鼠存活率很低，多在术后12h内发生意外死亡。因此，通过存活时间及microPET/CT显像可以剔除SAH伴脑出血大鼠。

本实验研究结果表明：术后2h，神经功能评分与microPET/CT评价准确性间的差异具有统计学意义；而术后24h，神经功能评分与microPET/CT评价准确性间的差异无统计学意义。在美国，溶栓时间窗及药物干预最佳开始时间一般限定在3h以内，某些药物对SAH、脑出血大鼠病灶也有改善，这会影响结果的观察、浪费实验耗材。因此，在进行动物药物干预实验研究时，有必要在术后3h内进行一次模型筛选。如果是血流灌注方面的动物实验，CT灌注或MRI作为评价模型及动态观察都是不错的影像手段；如果是MCAO/R模型脑组织能量代谢方面的研究，可将microPET/CT作为早期模型筛选、后期动态观察能量代谢变化的影像学方法。

利益冲突

利益冲突　无

参　考　文　献

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